J Virol. | 非洲豬瘟病毒pH240R通過(guò)抑制I型干擾素信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)病毒復(fù)制

ZhaoSunLab

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所翁長(zhǎng)江研究員團(tuán)隊(duì)于2024年3月在Journal of Virology上發(fā)表了一篇題為“African swine fever virus pH240R enhances viral replication via inhibition of the type I IFN signaling pathway”（非洲豬瘟病毒pH240R通過(guò)抑制I型干擾素信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)病毒復(fù)制）的文章,。

研究結(jié)果顯示，ASFV pH240R通過(guò)抑制I型干擾素信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)ASFV的復(fù)制,，這為開(kāi)發(fā)ASFV減毒活疫苗提供了線索,。

研究影響ASFV毒力和復(fù)制的重要蛋白是開(kāi)發(fā)有效疫苗和藥物的關(guān)鍵

IFN是一種重要的抗病毒細(xì)胞因子,，可在病毒感染過(guò)程中誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素刺激基因(ISGs),，發(fā)揮間接抗病毒作用,。已有研究表明,，ASFV pH240R是一種衣殼蛋白,，它參與ASFV的組裝。與親本ASFV HLJ/18相比,，含H240R基因缺失的重組ASFV(ASFV-ΔH240R)在豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)中誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平高于親本ASFV,。作者先前的研究表明，pH240R通過(guò)靶向STING抑制cGAS-STING信號(hào)通路來(lái)抑制I型干擾素的產(chǎn)生,。值得注意的是,，ASFV ΔH240R對(duì)IFN-α的敏感性高于親本ASFV HLJ/18，目前尚不完全清楚其作用機(jī)制,。

在本研究中,，作者發(fā)現(xiàn)ASFV pH240R通過(guò)抑制I型干擾素信號(hào)通路，抑制了IFN-α誘導(dǎo)的ISRE的激活和ISGs的表達(dá),。在機(jī)制上,，pH240R通過(guò)與IFNAR1和IFNAR2相互作用，顯著干擾了IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用,。此外,，與親本ASFV HLJ/18相比，ASFV-?H240R感染誘導(dǎo)了更多的ISGs,。作者還證實(shí),，pH240R通過(guò)抑制IFN-JAK-STAT信號(hào)通路而促進(jìn)ASFV的復(fù)制。這些研究結(jié)果顯示,，pH240R通過(guò)抑制I型干擾素信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)ASFV的復(fù)制,，這為開(kāi)發(fā)ASFV減毒活疫苗提供了線索。

研究結(jié)果

結(jié)果一：pH240R通過(guò)抑制I型干擾素信號(hào)通路增強(qiáng)ASFV復(fù)制

作者之前的研究表明,，與其親本ASFV HLJ/18相比,，IFN-α更顯著地抑制ASFV-ΔH240R的復(fù)制。為檢測(cè)I型干擾素信號(hào)通路對(duì)ASFV-ΔH240R復(fù)制的影響,，用抗IFNAR1或抗IFNAR2抗體阻斷豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）,，隨后用IFN-α處理，再用野生型ASFV(ASFV-WT)或H240R缺陷型ASFV（ASFV-ΔH240R）感染,。結(jié)果表明,，IFN-α對(duì)ASFV-?H240R的抑制作用強(qiáng)于其親本ASFV HLJ/18，而阻斷IFNAR1和IFNAR2則挽救了IFN-α對(duì)ASFV-HLJ/18和ASFV-ΔH240R復(fù)制的抑制作用,，表明IFN-α激活的I型干擾素信號(hào)通路是抑制ASFV復(fù)制所必需的(圖1A),。為了證實(shí)這一結(jié)論,，豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）進(jìn)行加或不加TYK2抑制劑的處理。結(jié)果表明,，與其親本ASFV HLJ/18相比,，TYK2抑制劑促進(jìn)了ASFV-ΔH240R在豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）中的復(fù)制，并減弱了IFN-α對(duì)ASFV-ΔH240R復(fù)制的抑制作用(圖1B),。

為了探討IFANR2及I型IFN信號(hào)通路對(duì)ASFV復(fù)制的影響,，用針對(duì)IFANR2基因的小干擾RNA（siRNA）感染PAM細(xì)胞，然后以相同基因組拷貝數(shù)108感染ASFV-WT或ASFV-ΔH240R 24 h,。結(jié)果表明,，感染ASFV-WT或ASFV-ΔH240R的PAM中，攜帶siIFNAR2誘導(dǎo)的Isg56的mRNA水平降低,，ASFV-ΔH240R誘導(dǎo)的Isg56的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比ASFV HLJ/18高(圖1C),。作者還發(fā)現(xiàn)，下調(diào)IFNAR2的表達(dá)增加了ASFV-WT和ASFV-ΔH240R的病毒滴度,，并且ASFV-ΔH240R的病毒滴度低于ASFV-WT(圖1D),。綜上所述，結(jié)果表明ASFV pH240R是ASFV復(fù)制所必需的,，它通過(guò)抑制I型干擾素信號(hào)通路而增強(qiáng)ASFV復(fù)制,。

圖1 ASFV pH240R通過(guò)抑制I型IFN信號(hào)通路增強(qiáng)ASFV復(fù)制

結(jié)果二：ASFV pH240R抑制ISGs的產(chǎn)生

為了評(píng)估ASFV pH240R對(duì)ISGs產(chǎn)生的潛在作用，將劑量遞增表達(dá)pH240R的質(zhì)粒分別與ISRE,、ISG54和ISG56中的一種報(bào)告基因,，與Renilla-TK Luc共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞24 h，隨后用IFN-α處理6 h,，收集細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè),。結(jié)果顯示，pH240R以劑量依賴(lài)的方式抑制ISRE,、ISG54和ISG56的啟動(dòng)子活性（圖2A-C）,。通過(guò)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示,，pH240R以劑量依賴(lài)的方式抑制ISG15、ISG54和ISG56的mRNA表達(dá)(圖2D-F),。綜上所述,，研究結(jié)果表明，pH240R抑制I型干擾素信號(hào)通路,。

圖2 ASFV編碼的pH240R抑制I型干擾素信號(hào)通路

結(jié)果三：ASFV-ΔH240R比ASFV-WT誘導(dǎo)更多的ISG

為進(jìn)一步檢測(cè)H240R基因在ASFV感染時(shí)對(duì)ISGs合成的影響,，用拷貝數(shù)為108的ASFV-ΔH240R或其親本ASFV-WT感染PAM細(xì)胞12h，隨后用IFN-α處理細(xì)胞12h,。收集細(xì)胞,，用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè)ISGs的mRNA表達(dá)水平,。結(jié)果顯示，與ASFV-ΔH240R相比,，ASFV-WT感染顯著抑制了IFN-α誘導(dǎo)的ISGs的基因表達(dá)水平（圖3A-D）,。作者注意到雖然ASFV-WT和ASFV-ΔH240R的基因組DNA拷貝數(shù)沒(méi)有差異，但ASFV-ΔH240R的基因組DNA拷貝數(shù)顯著低于ASFV-WT(圖3E),，排除了ASFV-ΔH240R對(duì)ISGs的影響是由于更多的病毒顆粒而不是H240R基因功能喪失所致,。

圖3 ASFV-ΔH240R比ASFV-WT誘導(dǎo)更多的ISG

 

結(jié)果四：ASFV pH240R通過(guò)與IFNAR1和IFNAR2相互作用來(lái)干擾IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用

為了進(jìn)一步闡明pH240R抑制I型IFN信號(hào)通路的靶點(diǎn)，作者首先檢測(cè)了pH240R是否通過(guò)直接靶向ISGF3來(lái)抑制ISGs的轉(zhuǎn)錄,。將表達(dá)pH240R和ISGF3組分的質(zhì)粒分別與ISRE報(bào)告基因和Renilla-TK Luc轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,。結(jié)果表明，pH240R不能抑制ISGF3介導(dǎo)的ISRE報(bào)告基因的激活(圖4A),，揭示pH240R負(fù)調(diào)控ISGF3上游的I型干擾素信號(hào)通路,。作者為進(jìn)一步探索pH240R在I型干擾素信號(hào)通路中的靶分子，將表達(dá)pH240R的質(zhì)粒與表達(dá)IFNAR1,、IFNAR2的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,，進(jìn)行免疫共沉淀（Co-IP）檢測(cè)。結(jié)果表明,，pH240R與IFNAR1和IFNAR2免疫沉淀（圖4B）,。隨后用ASFV-WT感染PAM 24 h后，用抗IFNAR1/IFNAR2抗體進(jìn)行Co-IP,，在感染ASFV的PAM中驗(yàn)證了內(nèi)源性IFNAR1/2和ASFV編碼的pH240R的相互作用(圖4C),。此外，作者還證實(shí)了在CRL-2843細(xì)胞中,，pH240R與IFNAR1和IFNAR2共定位(圖4 D,、E)。

圖4 ASFV pH240R與IFNAR1和IFNAR2相互作用 

I型干擾素與IFNAR1和IFNAR2結(jié)合,，分別募集TYK2和JAK1來(lái)觸發(fā)級(jí)聯(lián)信號(hào),。為了檢測(cè)ASFV pH240R是否干擾IFNAR1-TYK2或IFNAR2-JAK1的相互作用，將HA-IFNAR1/ HA-IFNAR2,、Flag-pH240R和Flag-TYK2/ JAK1單獨(dú)或共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行Co-IP（圖5A,、B）。將FLAG-pH240R表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞24 h,，加入IFN-α處理細(xì)胞6 h,，再用抗IFNAR1 抗體(圖5C)或抗 IFNAR2 抗體(圖5D)進(jìn)行Co-IP。結(jié)果表示,，過(guò)表達(dá)的pH240R顯著降低了外源IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1之間的相互作用,，以及內(nèi)源IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1之間的相互作用。已有研究報(bào)道在募集TYK2和JAK1后,，IFNAR1/2被磷酸化,，隨后TYK2和JAK1被自動(dòng)磷酸化,。作者還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH240R過(guò)表達(dá)時(shí),，IFNAR1,、TYK2和JAK1的酪氨酸磷酸化水平顯著降低。綜上所述,，結(jié)果表明,，pH240R通過(guò)與IFNAR1和IFNAR2相互作用來(lái)抑制IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用，并降低IFNAR1,、JAK1和TYK2的磷酸化水平(圖5E,、F)。

圖5 ASFV pH240R干擾IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用 

結(jié)果五：ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的磷酸化

STAT1和STAT2的磷酸化是I型干擾素信號(hào)通路下游的關(guān)鍵因子,。為了確定ASFV pH240R是否抑制了IFN-α誘導(dǎo)的STAT1和STAT2的磷酸化,，將表達(dá)pH240R的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞24 h，加IFN-α處理細(xì)胞6 h,，結(jié)果表明ASFV pH240R顯著抑制了IFN-α誘導(dǎo)的STAT1和STAT2的磷酸化(圖6 A,、B)。為進(jìn)一步檢測(cè)H240R基因缺失是否影響STAT1和STAT2的磷酸化,，用ASFV-WT或ASFV-?H240R感染PAM,，然后用IFN-α處理。作者發(fā)現(xiàn)ASFV-WT感染顯著抑制了IFN-α誘導(dǎo)的STAT1和STAT2的磷酸化水平,，而ASFV-ΔH240R感染減輕了ASFV-WT對(duì)STAT1和STAT2磷酸化的抑制(圖6 C,、D)。綜上所述,，結(jié)果表明,，ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的磷酸化。

圖6  ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的磷酸化

結(jié)果六：ASFV pH240R抑制ISGF3的三聚體形成

磷酸化的STAT1和STAT2形成異二聚體,，其募集IRF9而形成異三聚體復(fù)合體ISGF3,。作者為了探索ASFV pH240R在ISGF3復(fù)合體形成中的作用，將表達(dá)量不同的pH240R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞24 h,，隨后加入IFN-α處理6 h,。結(jié)果表明，pH240R顯著抑制IRF9-STAT1和IRF9-STAT2的相互作用（圖7A,、B）,。作者還發(fā)現(xiàn)，與其親本ASFV HLJ/18相比,，ASFV-ΔH240R感染PAM促進(jìn)了內(nèi)源IRF9-STAT1和IRF9-STAT2的相互作用(圖7C、D),。綜上所述,，pH240R不與IRF9相互作用,，但抑制了ISGF3的形成，從而中斷IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用,。

圖7 ASFV pH240R抑制ISGF3的三聚體形成

結(jié)果七：ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的核內(nèi)轉(zhuǎn)移

作者為了確定ASFV pH240R是否能抑制IFN-α誘導(dǎo)的STAT1和STAT2的核內(nèi)轉(zhuǎn)移,，將表達(dá)pH240R的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞24 h，然后加入IFN-α處理6 h,。結(jié)果表示,，過(guò)表達(dá)pH240R抑制了STAT1和STAT2的核轉(zhuǎn)位（圖8A、B）,。為進(jìn)一步檢測(cè)STAT1,、STAT2和IRF9的核內(nèi)轉(zhuǎn)移是否受H240R基因缺失的影響，用ASFV-WT或ASFV-?H240R感染PAM,，隨后加入IFN-α處理,。作者發(fā)現(xiàn)，與其親本ASFV HLJ/18相比,，H240R基因缺失促進(jìn)了STAT1,、STAT2和IRF9的核內(nèi)轉(zhuǎn)移(圖8C、D),。共聚焦結(jié)果表明,，pH240R的過(guò)表達(dá)抑制了STAT1和STAT2的核內(nèi)轉(zhuǎn)移(圖8 E-H)。綜上所述,，結(jié)果表明ASFV pH240R抑制了STAT1和STAT2的核內(nèi)轉(zhuǎn)移,，從而抑制了ISGs的產(chǎn)生。

圖8 ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的核內(nèi)轉(zhuǎn)移

本研究中,，作者發(fā)現(xiàn)ASFV pH240R是干擾素信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子,，通過(guò)IFNAR1和IFNAR2相互作用來(lái)破壞IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用，進(jìn)而抑制ISGs的表達(dá),，從而抑制I型干擾素信號(hào)通路以增強(qiáng)ASFV的復(fù)制,，揭示了pH240R作為潛在藥物靶點(diǎn)的可能性，為開(kāi)發(fā)ASFV減毒活疫苗和藥物提供了線索,。