引導(dǎo)編輯（Prime editing，PE），也稱為先導(dǎo)編輯,，作為一種新型基因編輯工具,，能夠在不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的情況下產(chǎn)生精確的DNA的替換,、刪除或插入,，PE系統(tǒng)由三部分組成,，分別是nCas9,、逆轉(zhuǎn)錄酶和pegRNA,，pegRNA除了包含向?qū)NA（sgRNA）外，還包含逆轉(zhuǎn)錄酶模板（RTT）和引物結(jié)合位點(diǎn)（PBS）,。

目前,，幾乎所有的引導(dǎo)編輯器均是依賴于Cas9蛋白開發(fā)而成,，但Cas9蛋白存在尺寸較大、脫靶效應(yīng)高和受限于G/C-rich區(qū)域編輯的缺點(diǎn),，限制了引導(dǎo)編輯器的廣泛應(yīng)用,。如何進(jìn)一步提升引導(dǎo)編輯器的編輯精度、消除靶點(diǎn)序列限制并降低遞送難度是基因組編輯領(lǐng)域亟待解決的重要技術(shù)難題,。

2024年1月10日,，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所高彩霞團(tuán)隊(duì)在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Prime editing using CRISPR-Cas12a and circular RNAs in human cells 的研究論文。

該研究介紹了該團(tuán)隊(duì)使用尺寸更小的Cas12a開發(fā)的四個(gè)環(huán)狀RNA介導(dǎo)的引導(dǎo)編輯器（CPE）：niCPE,、nuCPE,、sniCPE和snuCPE。與Cas9蛋白相比：Cas12a蛋白和其crRNA分子量都較小,，易于遞送,；Cas12a具有更低的脫靶效應(yīng)，適合疾病治療,；Cas12a蛋白識別基因組A/T-rich區(qū)域,，能夠編輯Cas9蛋白無法編輯的位點(diǎn)。所以,，基于Cas12a開發(fā)的引導(dǎo)編輯器將在基因治療和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有廣泛的應(yīng)用潛力,。

研究證明，Cas12a蛋白具有切割pegRNA（prime editing guide RNA）的特點(diǎn),，所以傳統(tǒng)的pegRNA并不適用于Cas12a引導(dǎo)編輯器的開發(fā),。利用Cas12a蛋白的不同形式，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了適合不同場景的基于環(huán)狀RNA的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)CPEs（circular RNA-mediated prime editors）：（1）基于切口酶的引導(dǎo)編輯器niCPE（nickase-dependent CPE, 圖1a）,；（2）基于雙鏈核酸酶的引導(dǎo)編輯器nuCPE（nuclease-dependent CPE, 圖1b）,；（3）可拆分niCPE的引導(dǎo)編輯器sniCPE（split nickase-dependent CPE, 圖1c）；（4）可拆分nuCPE的引導(dǎo)編輯器snuCPE（split nuclease-dependent CPE, 圖1d）,。niCPE和nuCPE在人類細(xì)胞系HEK293T中效率分別高達(dá)24.89%和10.42%,，適合慢病毒等大分子量遞送系統(tǒng)。sniCPE和snuCPE在HEK293T細(xì)胞中效率分別高達(dá)40.75%和3.19%,，適合AAV遞送,。除了HEK293T細(xì)胞以外，niCPE和sniCPE在HeLa,、N2A,、MCF7等細(xì)胞中也能有效產(chǎn)生精確的引導(dǎo)編輯（圖1e-f）。

圖1: 基于環(huán)狀RNA開發(fā)的CRISPR-Cas12a引導(dǎo)編輯系統(tǒng)

研究人員把靶向多個(gè)位點(diǎn)的多個(gè)crRNA串聯(lián)在一起,，置于環(huán)狀RNA的表達(dá)框中,，并把靶向多個(gè)位點(diǎn)的RTT-PBS序列也串聯(lián)在環(huán)狀RNA表達(dá)框中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，這樣的設(shè)計(jì)可以高效實(shí)現(xiàn)雙基因,、三基因甚至四基因的引導(dǎo)編輯,。研究人員進(jìn)一步檢測了CPE引導(dǎo)編輯器的脫靶效應(yīng)，結(jié)果表明CPE具有優(yōu)良的特異性,，幾乎沒有檢測到脫靶效應(yīng),。低脫靶效應(yīng)、高編輯效率的CPE系統(tǒng)為利用各種核酸酶開發(fā)為新型引導(dǎo)編輯系統(tǒng)提供了通用范式,，多類型的CPE系統(tǒng)在生物研究,、疾病治療和作物育種等多場景中將發(fā)揮巨大的潛力。

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所高彩霞研究組助理研究員梁榮洪,、博士生賀子欣,、齊禾生科生物科技有限公司Kevin Tianmeng Zhao博士為該論文的共同第一作者，高彩霞研究員為通訊作者,。該研究得到科技創(chuàng)新2030-生物育種重大項(xiàng)目,、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和新基石科學(xué)基金的經(jīng)費(fèi)資助。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41587-023-02095-x

來源丨組學(xué)大講堂

編輯丨農(nóng)財(cái)君

聯(lián)系農(nóng)財(cái)君丨18565265490

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